切向流過濾濃縮/洗濾慢病毒樣顆粒
來自美國維克森林大學和安徽師范大學的科學家們在2019年的《Nucleic Acids Research》雜志上發(fā)表了題為“Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing”的文章。文中，研究人員指出CRISPR/Cas9機制的瞬時表達不僅可降低脫靶導致的突變風險，還可降低針對Cas9蛋白質的潛在免疫反應，而其新近開發(fā)的系統(tǒng)通過適體和適體結合蛋白（ABP）之間的特定相互作用，可在單個慢病毒樣顆粒（Lentivirus-Like Particle, LVLP）中包裝達100個Cas9 mRNA 拷貝，基于此，研究人員開發(fā)了一種基于慢病毒衣殼的生物納米顆粒系統(tǒng)，其可高效包裝Cas9/sgRNA核糖核蛋白（RNP）。結果顯示，用一個com 適體替代sgRNA支架的四聚體，可保留向導RNA的功能，com-修飾的sgRNA可通過ABP和適體以及sgRNA和Cas9蛋白質之間的特定相互作用，將Cas9/sgRNA RNP包裝進慢病毒樣顆粒。這些RNP生物納米顆粒可在不同細胞中的不同靶點上產生插入和缺失，其效率與研究人員此前報道的Cas9 mRNA LVLP相當或更好。新系統(tǒng)反應快速，可降低脫靶率，使其在遞送Cas9 RNP用于瞬時Cas9表達和有效基因編輯時更方便、高效。
實驗中，研究人員使用HEK 293T細胞培養(yǎng)生產Cas9 RNP LVLP。培養(yǎng)結束后，使用KrosFlo® Research 2i 切向流過濾系統(tǒng)，以濃縮-洗濾-濃縮模式濃縮含有LVLP的上清液，簡單來說，150-300mL 上清液先濃縮至~50mL，以500-1000mL PBS洗濾，最后濃縮至~8mL。中空纖維組件材質為mPES（改性聚醚砜），MWCO為500kD。D02-E500-05-N組件的流速和壓力維持為80ml/min和8psi，C02-E500-05-N的流速和壓力維持為10ml/min和5psi。
原文：P.Lyu, P.Javidi-Parsijani, A.Atala, et al., Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing. Nucleic Acids Research, 2019, doi:10.1093/nar/gkz605.
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