簡介

開發更復雜的、生物相關的和預測的基于細 胞的化合物篩選方法是藥物發現中的一個主 要挑戰。三維 (3D) 分析模型的開發和集成 正變得越來越流行，并驅動著生物轉化學 的發展。具體而言，3D 培養物具有精致濃 縮了人體組織各方面特征的優點，包括結 構、細胞組織、細胞-細胞和細胞-基質相 互作用，以及更多生理相關的特征延伸。

水凝膠廣泛用于模擬在 3D 環境中生長的神 經細胞的細胞外基質。水凝膠是聚 ( 乙二 醇 ) (PEG) 為基礎，完全合成的，全透明 的物質。水凝膠通過摻入 MMP 切割位點 來幫助細胞遷移，并包含 RGD 細胞粘連基 序以支撐細胞的粘附作用。完全合成的水 凝膠是預先鋪展在 96 孔板中，其特征在 于深層次的密度梯度促進細胞在水凝膠表 面上進行三維滲透 ( 3D ProSeedTM 水凝 膠，ECICA 技術 )。這種水凝膠預制板使 用方法簡便，同時能很好的兼容自動化設 備 ( 圖 1 )。 

同時，人類誘導的多能干細胞 (iPSC) 衍生 的神經元也越來越多地用于生理細胞模型 的開發;與用于神經科學應用的原代細胞和 動物模型相比，它們的人類起源，更長久 的再生能力和無限量的可用性使它們在神 經系統科學應用中獨具優勢。 

在多孔板中形成 3D 神經元網絡 

我們優化了 96 孔板的細胞培養和染色，并 發展了完善的共聚焦成像及分析方法，讓 神經元以 3D 模型的形式進行形態表型和生 存能力的測量用于測定的細胞是 CN.4UTM (Axiogen AG)，是由神經元 ( 谷氨酸能、多巴胺能和 GABAergic ) 和星形膠質細胞組成的人 iPSC 誘導細胞混合體。CNS.4UTM 細胞在 3D ProSeedTM 水凝膠 (Ectica Technologies) 中孵育 14 天。細胞以 40000 個神經元每 孔的密度培養在 200 μl 培養基中。對于選 定的研究，也評估了細胞接種密度的影響 ( 5000 ～ 8000 個細胞/孔 )。培養基的組 成包括 50:50 混合神經基礎培養基 + DMEM / F12 + 補充劑 (Axiogenesis)。 

細胞接種在水凝膠的表面，然后滲透到水 凝膠內部 ( 圖1 )。神經突起生長開始于種 植后 24 h，接著連續培養 14 天以上。通 過透射光成像監測神經網絡的形成過程。 對于端點測量，使用 4% 甲醛固定細胞， 然后用 0.1% 的 Triton X-100 通透，并用 熒光抗體結合抗體對 TUJ-1 神經元標記物 染色，加上 Hoechst 核染色。

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