細胞培養(yǎng)過程中，傳代是非常重要的環(huán)節(jié)，若操作不當會給細胞帶來不可逆轉(zhuǎn)的傷害，原代細胞因其培養(yǎng)難度高且傳代次數(shù)有限，細胞消化的步驟需要格外細心與謹慎。美國ScienCell公司根據(jù)其豐富的原代細胞培養(yǎng)經(jīng)驗，總結(jié)出一套細胞消化的方法，有效降低了消化步驟對細胞的操作。現(xiàn)分享給大家：

1. 當細胞達到80-90%融合時需要傳代培養(yǎng)。

2. 提前準備好多聚賴氨酸（PLL，貨號0403）或纖維粘連蛋白（BPF，貨號8248）包被好的培養(yǎng)瓶。

3. 將完全培養(yǎng)基，胰酶/EDTA消化液（T/E，貨號0103），胰胰中和液（TNS，貨號0113）和不含鈣鎂離子的DPBS（貨號0303）加熱至室溫。我們不推薦用37度水浴加熱試劑和培養(yǎng)基。

4. 用DPBS沖洗細胞。

5. 以T-75培養(yǎng)瓶為例，向培養(yǎng)瓶中加入8mlDPBS，然后加入2ml胰酶/EDTA消化液。輕輕搖動培養(yǎng)瓶保證細胞被胰酶/EDTA消化液完全覆蓋。將培養(yǎng)瓶置于37度培養(yǎng)箱1-2分鐘直到細胞變圓。在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

6. 在消化期間，準備一支50ml離心管加入5ml胎牛血清（FBS，貨號0500）。

7. 將胰酶/EDTA消化液從培養(yǎng)瓶中吸出至50ml離心管中（一小部分細胞已消化下來），將培養(yǎng)瓶繼續(xù)置于37度培養(yǎng)箱中1-2分鐘（此時培養(yǎng)瓶中沒有液體）。

8. 在孵化結(jié)束時，輕輕拍打培養(yǎng)瓶側(cè)面使細胞脫離表面。在顯微鏡下檢查以確保所有細胞已脫離。

9. 向培養(yǎng)瓶中加入5ml胰酶中和液，將消化后的細胞轉(zhuǎn)移至50ml離心管中。再加入5ml胰酶中和液沖洗培養(yǎng)瓶，以保證所有細胞被收集。

10. 在顯微鏡下觀察剩余細胞數(shù)量以確定是否收集成功，細胞數(shù)量應小于5%。

11. 以1000轉(zhuǎn)/分離心收取的細胞懸液5分鐘，然后在培養(yǎng)基中重懸細胞。

12. 細胞計數(shù)，然后將細胞以推薦的細胞密度接種在包被好的培養(yǎng)瓶中。

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