膀胱癌（Bladder cancer）是一種常見的泌尿系統腫瘤，由于易轉移，死亡率高，5年生存率只有8.1%。因此，研究膀胱癌的發病機制，有助于對膀胱癌的診斷和治療。circRNA是一類具有閉合環形結構的非編碼RNA，是現階段轉錄組學研究的新星。本研究從circRNA的角度出發，深入闡述了一個circRNA在膀胱癌中的作用機制。

1. 膀胱癌特異性circRNA的篩選與鑒定

為篩選和膀胱癌特異性相關的circRNA，研究人員對3對配對癌組織和正常膀胱組織進行了circRNA特異性的高通量測序（伯豪生物參與），共鑒定到16,353個circRNA。其中，有88.35.%的circRNA來源于exons，有524個在癌組織中下調，47個上調。

接下來，研究人員在膀胱癌細胞系（T24T和UMUC3）中進行了RT-PCR驗證，發現circHIPK3穩定地在兩種細胞系中表達。進一步的分析和大樣本鑒定表明，circHIPK3在79.5%的膀胱癌組織中特異性降低，并與grade, invasion和淋巴結轉移相關。FISH實驗表明，circHIPK3主要定位于細胞質中。

2. circHIPK3抑制膀胱癌細胞的遷移和侵襲

為探究circHIPK3的生物學功能，研究人員在兩個細胞系中過表達circHIPK3，進行細胞表型檢測。結果顯示，細胞遷移和侵襲受到抑制。當siRNA敲降circHIPK3時，細胞遷移和侵襲增強。因此，circHIPK3在膀胱癌細胞中影響了細胞的遷移和侵襲能力。

3. circHIPK3在膀胱癌細胞中大量吸附miR-558

在第一篇circHIPK3的研究中，其就是通過miRNA sponge方式發揮功能。那么，在膀胱癌中，是否也是ceRNA方式呢？通過miRanda，PITA和RNAhybrid預測，發現有12個miRNA能與之結合。Pull down實驗表明，miR-558能在T24T和UMUC3中與circHIPK3結合。進一步的突變實驗也驗證了兩者的結合關系，FISH實驗也驗證了兩者在細胞質中的共定位。因此，circHIPK3能直接結合miR-558。

4. miR-558通過靶向HPSE影響膀胱癌細胞的遷移，侵襲和血管生成

先前的研究表明，miR-558在神經母細胞瘤中通過促進HPSE的轉錄，而影響遷移，侵襲和血管生成，而HPSE又在膀胱癌中高表達。因此，研究人員在膀胱癌組織和細胞系中對miR-558進行了驗證，確實發現表達上調。然后，通過過表達實驗，也發現膀胱癌細胞的遷移和侵襲增強。而抑制miR-558表達時，出現了相反的細胞表型。RT-PCR和Weston blot實驗表明，HPSE，VEGF，MMP-9表達在過表達時增強，抑制表達時減弱。因此，miR-558通過靶向HPSE影響膀胱癌細胞的遷移，侵襲和血管生成。

5. 過表達circHIPK3逆轉miR-558對細胞的影響

circHIPK3和miR-558的結合關系搞清楚了，兩者的生物學功能也是一致的，那么他們是不是通過這種關系在同一條路上起作用呢？結果顯示，過表達circHIPK3，HPSE，VEGF，MMP-9表達顯著降低，而當敲降circHIPK3時，都顯著上調。那么是否是通過結合miR-558發揮功能呢？把miR-558 mimic和過表達circHIPK3共轉染，可以發現HPSE，VEGF，MMP-9表達顯著降低了，遷移和侵襲也降低。因此，circHIPK3確實是通過吸附miR-558，調控了HPSE的轉錄來影響細胞的遷移，侵襲和血管生成。

6. 小鼠模型實驗驗證circHIPK3的生物學功能

體外細胞實驗驗證了功能，在體內是否work，這是一個問號。因此，研究人員將轉染circHIPK3的T24T細胞移植到裸鼠中。結果顯示，腫瘤的生長速率和質量比對照低。免疫組化實驗顯示，HPSE，VEGF，MMP-9表達受到抑制，CD31+，平均血管密度減少。另外，轉移模型實驗也明顯顯示，過表達circHIPK3的小鼠肺轉移能力減弱。因此，小鼠實驗也有效地驗證了circHIPK3對膀胱癌生長，血管生成和轉移的影響。

研究結論

本研究通過高通量篩選，體內體外的功能驗證實驗，報道了一個已經有研究的circRNA在膀胱癌中的生物學功能。當然，在膀胱癌中，circHIPK3是第一次報道，也是通過了吸附和之前報道的不同的miRNA發揮功能。因此，做circRNA研究，無論是有過研究，還是沒有研究過的，只要能把機制說清楚了，功能說明白了，都能在比較好的雜志上發表。

原文出處：Li Y, Zheng F, Xiao X, Xie F, Tao D, Huang C, Liu D, Wang M, Wang L, Zeng F, Jiang G. CircHIPK3 sponges miR-558 to suppress heparanase expression in bladder cancer cells. EMBO reports.2017.