【蛋白研究系列專題】-13丨ELISA的真真假假

ELISA被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、食品安全、臨床診斷等領(lǐng)域，是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。在實(shí)際應(yīng)用中，ELISA操作的各方面均對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，如移液器的使用、樣本存放、加樣、溶血、試劑溫度、避光等。除此之外，一些非主觀因素也會(huì)對(duì)結(jié)果造成較大偏差。

ELISA實(shí)驗(yàn)中的假陰性和假陽性結(jié)果，讓各位實(shí)驗(yàn)君頭都大了吧？欲哭無淚吧？今天，小編和各位一起分享下假陰性、假陽性的原因及解決辦法。

假陰性

①標(biāo)本用肝素或EDTA等抗凝處理，易造成HBsAg檢測(cè)結(jié)果假陰性。肝素抗凝血漿會(huì)增加OD值,可能與高濃度肝素具有強(qiáng)大的負(fù)電荷，能吸附酶標(biāo)記物不易洗脫有關(guān)。EDTA、酶抑制劑（如NaN₃）可抑制ELISA系統(tǒng)中的辣根過氧化物酶活性，造成假陰性。

肝素                        

②采用雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如果用一步法測(cè)定，而此時(shí)被測(cè)物濃度過高，則可能由于勾狀效應(yīng)導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為陰性。為避免這種情況可以對(duì)樣本進(jìn)行稀釋，或者直接改用雙抗體夾心兩步法。

雙抗體夾心法               

③樣本內(nèi)被測(cè)物的濃度較低，也易造成假陰性結(jié)果。比如某些疾病發(fā)展初期被檢物濃度低于檢測(cè)限。

④某些情況下，個(gè)別個(gè)體的基因突變也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果為假陰性。尤其是檢測(cè)用抗體的結(jié)合位點(diǎn)在突變區(qū)的情況下，這種情況雖然極其罕見，但是也可能存在的。

假陽性

假陽性的出現(xiàn)通常是樣本中摻雜有同源或同工物質(zhì)，例如類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、交叉反應(yīng)物質(zhì)和其它物質(zhì)等。

類風(fēng)濕因子              

①血液樣本處理時(shí)，如有溶血會(huì)使樣本中具有弱過氧化物酶活性的亞鐵血紅素催化底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，在處理ELISA最常檢查的血清樣本時(shí)，要注意凝集過程、離心過程等細(xì)節(jié)，避免出現(xiàn)溶血和摻雜血細(xì)胞。

②RF（一種能結(jié)合多種動(dòng)物IgG Fc的自身IgM抗體）可與酶標(biāo)二抗Fc結(jié)合造成假陽性。為避免這種情況，在檢測(cè)抗原時(shí)可加入2-巰基乙醇使RF降解，或用熱變性IgG（63℃，10 min）進(jìn)行封閉處理。另外，使用F(ab)₂替代完整的IgG也可達(dá)到目的。一些其他的嗜靶抗原自身抗體，如抗甲狀腺球蛋白、抗胰島素球蛋白等在檢測(cè)時(shí)，可能與靶抗原結(jié)合形成復(fù)合物，干擾測(cè)定結(jié)果。所以在測(cè)定前需用理化方法將其解離后再測(cè)定。

③補(bǔ)體一方面會(huì)使一抗和酶標(biāo)二抗分子發(fā)生變構(gòu)暴露出Fc段C1q分子結(jié)合位點(diǎn)，從而將二者連接起來造成假陽性。另一方面也可能會(huì)結(jié)合固相抗體從而封閉其與抗原的結(jié)合表位而造成假陰性。所以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)用血清、動(dòng)物血清樣本進(jìn)行56 ℃ 30 min的補(bǔ)體滅活是有必要的。另外，通過用EDTA稀釋樣本也可降低這種作用。

補(bǔ)體C1q                   

④樣本中存在的類地高辛、類AFP等物質(zhì)能與抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)。尤其在使用單抗測(cè)定抗原時(shí)，如果正好交叉反應(yīng)的抗原決定簇是單抗結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

地高辛                      

⑤如樣本中因?qū)嶒?yàn)處理或污染含有某些細(xì)菌，如表皮球菌，菌體釋放的內(nèi)源性HRP可能會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成假陽性。

在ELISA檢測(cè)中為了避免出現(xiàn)假陰性或假陽性，不僅要嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，還要對(duì)與標(biāo)本相關(guān)的各因素進(jìn)行分析，采用對(duì)應(yīng)措施排除干擾物質(zhì)的干擾作用，做到檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確一致。