Genome Research丨lncRNA在精子發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用

一直被很多科學(xué)家認(rèn)為是真核生物基因組進(jìn)化中“垃圾”信息的非編碼RNA（ncRNA），既不編碼蛋白質(zhì)，又缺乏生物學(xué)功能的遺傳學(xué)證據(jù)，近幾年得到了“平反”，越來越多的研究表明ncRNA 在劑量補(bǔ)償效應(yīng)(Dosage compensationeffect)、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)控和細(xì)胞分化調(diào)控等眾多生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，成為遺傳學(xué)研究熱點(diǎn)。

隨著高通量測序技術(shù)發(fā)展，越來越多的lncRNA被證明在睪丸和腦組織中呈現(xiàn)高度特異性表達(dá)，這暗示著在精子發(fā)生與神經(jīng)調(diào)控兩個(gè)基礎(chǔ)生命學(xué)過程中，lncRNA的功能機(jī)制具有代表性。 

清華大學(xué)高冠軍實(shí)驗(yàn)室于2016年9月1號(hào)在Genome Research正式刊發(fā)題為《Critical roles of long noncoding RNAs in Drosophila spermatogenesis》的文章。此文章詳細(xì)闡述了lncRNA在精子發(fā)生過程中的重要作用，為揭示“暗物質(zhì)lncRNA”具有重要生物學(xué)功能提供了大量的遺傳學(xué)證據(jù)。

高冠軍研究小組選擇基因強(qiáng)凈化的模式生物果蠅為代表，通過高通量遺傳動(dòng)物模型的建立，鑒定了128個(gè)睪丸特異性表達(dá)的lncRNA。然后運(yùn)用優(yōu)化后的CRISPR技術(shù)建立了105個(gè)lncRNA基因敲除體。通過觀察并分析雄性果蠅精子發(fā)生、發(fā)育、活力等，發(fā)現(xiàn)近1/3的lncRNA基因的缺失會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)育異常甚至完全不育。

圖1 剔除研究的睪丸特異性lncRNA的鑒定和選擇的流程圖。使用生物信息學(xué)和在FlyBase中注釋的lncRNA的分析的新型lncRNA組合以構(gòu)建lncRNA起始庫。然后，通過睪丸特異性表達(dá)篩選和RNA原位雜交，選擇128種睪丸特異性lncRNA候選物用于靶向敲除。這些lncRNA位于三個(gè)不同的染色體上，包括染色體2的左臂和右臂，染色體3的左臂和右臂和染色體X。

圖2 lncRNA突變體導(dǎo)致雄性特異性生育缺陷。 （A）105個(gè)lncRNA突變體的生育概況。 （B）刪除lncRNA CR44455 / 6導(dǎo)致雄性不育，而CR44455 / 6 - / - 雌性完全能育。 （C）對(duì)CR42858 - / - 的雄性和雌性突變果蠅進(jìn)行定性生育力測定。 刪除CR42858大大降低了雄性的生育力，但雌性不受影響。

而通過異位轉(zhuǎn)基因方法發(fā)現(xiàn)，lncRNAs敲除的果蠅可以完全或部分修復(fù)異常，表明這些lncRNAs主要以反式（trans）發(fā)揮作用。高冠軍小組還通過基因表達(dá)譜分析得出，大部分功能性lncRNAs在精子發(fā)生過程中調(diào)控全局基因的表達(dá)。進(jìn)化分析表明，相比起編碼基因，lncRNAs演化更快，且具有更大功能重要性的lncRNAs具有較高的序列保守性，暗示它們處于不斷的進(jìn)化選擇之下。與蛋白編碼基因的開關(guān)調(diào)控作用不同的是，lncRNA可能多通過微調(diào)的方式調(diào)控全局基因表達(dá)，從而影響雄性生殖細(xì)胞分化。

高冠軍小組的這個(gè)研究意義在于彌補(bǔ)了大量功能性lncRNA在動(dòng)物活體水平所缺乏遺傳學(xué)證據(jù)的空白，開啟了lncRNA所傳遞的生命信息研究的大門。接下來為大家附上這篇文章的摘要。

摘要：

Long noncoding RNAs (lncRNAs), a recently discovered class of cellular RNAs, play important roles in the regulation of many cellular developmental processes. Although lncRNAs have been systematically identified in various systems, most of them have not been functionally characterized in vivo in animal models. In this study, we identified 128 testis-specific Drosophila lncRNAs and knocked out 105 of them using an optimized three-component CRISPR/Cas9 system. Among the lncRNA knockouts, 33 (31%) exhibited a partial or complete loss of male fertility, accompanied by visual developmental defects in late spermatogenesis. In addition, six knockouts were fully or partially rescued by transgenes in a trans configuration, indicating that those lncRNAs primarily work in trans. Furthermore, gene expression profiles for five lncRNA mutants revealed that testis-specific lncRNAs regulate global gene expression, orchestrating late male germ cell differentiation. Compared with coding genes, the testis-specific lncRNAs evolved much faster. Moreover, lncRNAs of greater functional importance exhibited higher sequence conservation, suggesting that they are under constant evolutionary selection. Collectively, our results reveal critical functions of rapidly evolving testis-specific lncRNAs in late Drosophila spermatogenesis.

高冠軍簡介：

高冠軍博士，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 PI，博導(dǎo)。2005年6月獲浙江大學(xué)生物物理學(xué)博士學(xué)位。2011年至今被清華大學(xué)生命學(xué)院聘為PI和博士生導(dǎo)師。目前，通過運(yùn)用實(shí)驗(yàn)室在國際上率先建立的CRISPR與phiC31重組酶相結(jié)合的高效果蠅基因打靶系統(tǒng)（knock-out和knock-in），綜合運(yùn)用遺傳與生化相結(jié)合的方法與技術(shù)，規(guī)模化研究染色質(zhì)表觀遺傳學(xué)相關(guān)因子（如非編碼RNA及組蛋白修飾等）在生殖系統(tǒng)及胚胎早期發(fā)育進(jìn)程中的生物學(xué)功能及相應(yīng)的分子作用機(jī)制。研究成果多次發(fā)表在Nature、Genome Research、PNAS、EMBO J、Genetics、G3：Genes|Genomes|Genetics、Nature Microbiology等國際學(xué)術(shù)期刊上。

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