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GST蛋白純化步驟

瀏覽次數:6380 發布日期:2016-7-11  來源:南京厚百電子商務有限公司

制備細胞裂解物:

1.每100ml培養物的細胞沉淀懸于4mlPBS;

2.加入溶菌酶至終濃度1mg/ml,冰上放置30min;

3.用針筒將10ml 0.2%Triton X-100強行注入細胞裂解物中,劇烈震動數次混勻;

4.加入DNase和RNase至終濃度5μg/ml,4℃震動溫育10min;

5.4℃ 3000g(5000r/min)離心30min;

6.上清轉移到一只新試管,加入DTT至終濃度為1mmol/L。

純化融合蛋白:

7.細胞裂解物與50%谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂勻漿混合,每100ml細胞培養物加2ml樹脂,于室溫下輕搖0min;

8.混合物于4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清并留樣少許進行SDS-PAGE;

9.沉淀中加入10倍標準體積的PBS,顛倒離心管數次混勻,洗去未與樹脂結合的蛋白;

10.4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清并留樣少許進行SDS-PAGE;

11.重復步驟9和10兩次;

12.結合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脫緩沖液洗脫,也可用凝血酶腸激酶或Xa因子切割,釋放靶蛋白。

    用谷胱甘肽洗脫融合蛋白:

    a. 沉淀中加入1倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫緩沖液,室溫輕輕攪動10min,洗脫樹脂上結合的蛋白;

    b. 4℃以500g(2100r/min)離心5min,上清移至新管中;

    c. 重復步驟a和b兩次,合并3次的上清。

    蛋白酶解從結合的GST融合蛋白上回收靶細胞:

    a. 在結合了融合蛋白的樹脂中加入凝血酶,腸激酶或Xa因子。每毫升樹脂加入50單位溶于1mlPBS的蛋白酶,顛倒離心管數次混勻,室溫下震蕩2-16h,用小規模實驗確定精確時間;

    b. 4℃以500g(2100r/min)離心5min,上清移至新管中;

13.10%SDS-PAGE分析每一步(細胞抽提,洗滌和洗脫)樣品的蛋白質組成。

谷胱甘肽瓊脂糖樹脂的處理:

1.輕輕顛倒盛有谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂的容器,將樹脂混成勻漿;

2.取部分勻漿放入15ml聚丙烯管(每100ml細菌培養物需要2ml勻漿);

3.4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清;

4.在樹脂中加入10倍柱床體積的冷的PBS,顛倒數次,混合勻漿,4℃以500g(2100r/min)離心5min,小心去掉上清;

發布者:南京厚百電子商務有限公司
聯系電話:025-52333444
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