一步搞定Th細胞檢測中的PMA和離子霉素的刺激濃度
1、 按照聯科生物 “人Th1&Th2 檢測方法”或“小鼠Th1&Th2 檢測方法”制備樣本；
2、 準備6份樣本，按以下濃度加入刺激劑和阻斷劑，37 ℃ 5% CO2 培養4~6小時（不要超過6小時），中間混勻幾次。
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1）PMA 25ng/ml Ionomysin 1ug/ml |
2）PMA 125ng/ml Ionomysin 1ug/ml |
3）PMA 250ng/ml Ionomysin 1ug/ml |
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4）PMA 25ng/ml Ionomysin 1ug/ml BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml) |
5）PMA 125ng/ml Ionomysin 1ug/ml BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml) |
6）PMA 250ng/ml Ionomysin 1ug/ml BFA 10ug/ml (或monensin 1.7ug/ml) |
注：濃度梯度可自由調整，以獲得最佳的刺激濃度
3、 將刺激后的血樣分別做流式檢測
第一管：正常樣本未刺激 CD4+胞外CD69
第二管：1）樣本 CD4+胞外CD69
第三管：2）樣本 CD4+胞外CD69
第四管：3）樣本 CD4+胞外CD69
第五管：5）樣本 CD4+胞外CD69
以上五管處理方法：
每管加100ul刺激后的細胞，按說明書加入適量的CD4和CD69抗體，室溫避光孵育15min。
用2ml預冷PBS洗一次，300g離心5min，棄上清。
用500ul PBS 重懸細胞，上機檢測
第六管：4）樣本 CD4+胞內CD69
第七管：5）樣本 CD4+胞內CD69
第八管：6）樣本 CD4+胞內CD69
第九管：2）樣本 CD4+胞內CD69
以上四管處理方法：
每管加100ul刺激后的細胞，按說明書加入適量的CD4，室溫避光孵育15min。
用2ml預冷PBS洗一次，300g離心5min，棄上清。
渦旋打散沉淀后加入 固定劑 工作液，混勻，4℃避光孵育60分鐘。
加2ml破膜劑工作液（eBioscience）或PBS（Invitrogen）洗一次，300g離心5min，棄上清
可以重復6-7步一次，最后管內殘留液體盡量少，倒出液體后用吸水紙蘸干。
加入破膜劑工作液100ul，同時加入適量的CD69抗體。
離心洗滌細胞并棄去上清液。
重復上一步洗滌細胞。
用500ul PBS重懸細胞，上機檢測。
4、結果處理：
不加阻斷劑的樣本，胞外CD69表達為90%以上
加阻斷劑的樣本，胞內CD69表達為90%以上，則選擇此時的刺激劑濃度作為最佳濃度。
5、Th1/Th2/Th17檢測步驟，請參照胞內CD69的染色，即把CD69抗體換成同型對照或者相應的細胞因子抗體即可。
