凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)最初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。 

重要試劑：

Boitin-N4-CTP           (invitrogen    # 15918-18)

TdT                          (NEB        # M0252L)

Poly(dI.dC)               (sigma       ＃P4929)

Hybond-N 尼龍膜       (Amersham   ＃RPN303B)

發(fā)光底物                    (寧波    唯奧)

緩沖液：

Buffer A  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                  10mM

KCl                                    10mM

EDTA                                0.1mM

DTT(fresh added)                 1mM

PMSF(fresh added)            0.5mM

 

Buffer B (store at 4℃)

0.5M EDTA in PBS (pH7.4)

 

Buffer C  (store at 4℃)

Hepes  (pH7.9)                 20mM

NaCl                                  0.4M

EDTA                                 1mM

DTT(fresh added)                1mM

PMSF(fresh added)              1mM

 

Buffer I  (store at RT)

Tris (pH7.5)             0.1M

NaCl                           1M

MgCl₂                       2mM    

 

Buffer II (pH7.5) (store at RT)

馬來酸                     100mM

NaCl                       150mM

 

Buffer III  (store at RT)

Tris(pH9.5)              100mM

NaCl                        100mM

MgCl₂                        50mM

 

Blocking Buffer (store at 4℃)

0.3％Tween-20, 0.3%Triton X-100, 5%BSA in Buffer I

 

Wash Buffer

0.3％Tween-20 in Buffer II

 

20×SSC (1L  pH7.0)

NaCl                 175.3g

檸檬酸鈉              88.2g

10×Binding Buffer (store at -20℃) [在公司（碧云天）購買：5×binding buffer,內(nèi)含Poly(dI.dC)]

Tris (pH7.5)                  0.1M

KCl                               0.5M

DTT                            10Mm

 

Poly(dI.dC) (store at -20℃)

1mg/ml in  TE (pH7.5)

 

SA-HRP(儲存液store at -20℃ 工作液store at 4℃)

1mg/ml in  50%PBS (pH7.2) 50%Glycerin

 

5×TBE  (5L)

EDTA                         18.612g

硼酸                       139.1175g

Tris                         272.565g

  

5×TdT Reaction Buffer (store at -20℃) (pH7.2)

Sodium cacodylate              0.5M

CoCl2                               10mM        

TCEP                                  1mM

 

Biotin-N4-CTP (store at -20℃)

Biotin-N4-CTP               50mM

Tris (pH7.5)                  10mM            

EDTA                              1mM

    ddw                             ――

    10×binding buffer         2μl

    Poly(dI.dC)                   1μl    （以上文字已說明由公司定）

    核蛋白粗提物                  4－10μg（溫和混勻）

    生物素標(biāo)記的探針            0.5μl

室溫反應(yīng)20min，加入6×Loading Buffer (TAKARA) 4μl，上樣10－20μl，100V電泳至溴酚藍(lán)于三分之二處。

2. 電轉(zhuǎn)前將尼龍膜浸泡于0.5×TBE至少10min

以預(yù)冷的0.5×TBE為電轉(zhuǎn)緩沖液100V轉(zhuǎn)膠于尼龍膜上，45min。
3. UV BOX下，以貼近膜一面面向紫外光源，以254nm激發(fā)光交聯(lián)15min（紫外交聯(lián)儀1200能量，照2次）

4. 加入25mLBlocking Buffer，以約70rpm在脫色搖床上封閉30min

5. 將SA-HRP以1:30000-50000稀釋于12mL Blocking Buffer，脫色搖床70rpm作用20min

(洗膜過程全部在脫色搖床上進(jìn)行, 約100-140prm)

6. Buffer II  25ml,  5min
7. wash buffer 25ml  15min
8. Buffer III  25ml  5min×2次
9. 0.1%SDS in 2×SSC, 5min×2次
10. 0.1%SDS in 1×SSC, 10min×2次
11. 0.1%SDS in 0.5×SSC, 5min×2次
12. 將膜于濾紙稍適吸干，加入到以1:20稀釋的發(fā)光反應(yīng)液(寧波奧唯)，作用1-5 min，將尼龍膜封于保鮮膜中（避免褶皺和氣泡的產(chǎn)生），暗室曝光1-5min，檢測信號。

使用此protocol效果圖

 

 

圖1. 用10ng/ml的mLT-?刺激MEF細(xì)胞，分別刺激0、15、30、60、120min，檢測NF-?B的量。（p：probe only. 只加入標(biāo)記探針未加入核蛋白抽提物）