選擇合適的緩沖液對于維持一定pH值下蛋白質的穩定及保證實驗的重復性很重要。PBS的緩沖能力強于TBS，TBS在pH7.0以下緩沖能力較弱。一般根據實驗目的選用合適的緩沖液，如在蛋白純化中進行陰離子交換層析，陽離子緩沖液首選TBS；陽離子交換層析時，陰離子緩沖液首選PBS。Western blot中使用PBS和TBS均可，根據需要選擇合適的濃度。

 不一定，因為有的抗體是識別線性表位的，有的是識別構象型表位，識別構象型表位的抗體不能用于Western blot，因為在Western blot中抗體識別的是完全變性的蛋白質抗原，而蛋白質抗原的構象型表位變性時被破壞。

最好不要同時加兩種一抗，因為如果結果里面有非特異性信號的話，就說不清楚。做Western在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗、ECL顯色、壓片、洗片，漂洗后加內對照的一抗、二抗、ECL顯色、壓片，洗片。

可以考慮，轉移緩沖液中加入20%甲醇，因為甲醇可以降低蛋白質洗脫效率，但可增加蛋白質和NC膜的結合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質可延長轉移時間；轉移緩沖液中加入終濃度0.1% SDS，也是為了增加轉移效率；用優質的轉移膜，或使用小孔徑的NC膜，低濃度膠，提高轉移電壓/電流，增加轉移時間。

 一抗、或二抗抗體濃度太高，多克隆抗體本身的非特異性反應，抗體的特異性不強，目的蛋白經過處理后發生變化，而內參的條帶基本均勻一致，這樣才有說服力。表明的確是處理因素造成目的蛋白的變化而不是加樣誤差或人為造成目的條帶濃度的變化，嚴格意義上講，內參是必須的。