二抗孵育（Secondary antibody inucubation）

    參考二抗的說明書，按照適當比例用封閉液稀釋辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗。

    吸盡洗滌液后，立即加入稀釋好的二抗，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動孵育1~2小時�；厥斩�抗。然后加入Western洗滌液，在搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘。共洗滌3次。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間并增加洗滌次數。

    前2步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結合，減少背景。同時短時間多次的洗膜（如 5-6次，每次 3分鐘）比長時間少次數的洗膜更有效。

    第3步TBS洗滌是為了洗去膜上的Tween-20,因為它可以阻礙底物的沉積。

    注意事項

    1） 抗體保存注意事項：

    2）收到抗體后按要求離心后再打開管蓋進行分裝和保存！

    3）對于大部分抗體，比較合適的保存方式是分裝后保存在-20℃ .

    4）分裝的量以一次實驗用完為好，最少不能少于10 ul每份。因為分裝體積越小，抗體的濃度越可能會受到蒸發以及管壁吸附的影響。

    5）復融后的分裝抗體如果一次用不完，將剩余母液保存在40℃，避免再凍起來！

    6）絕對避免將抗體保存在自動除霜冰箱中。

    7）大部分抗體收到后40℃短暫保存1-2周對抗體活性是沒有影響的。

    8）長期保存，加入疊氮納，防止細菌污染。

    一抗/二抗使用問題：

    一抗、二抗的濃度一般要參照抗體說明書選擇最適當的比例，一抗二抗的選擇直接影響實驗結果以及背景的深淺。要嚴格保證反應時間，洗膜要注意盡可能地將一抗二抗洗凈，有利于降低背景；還要注意一抗二抗的匹配。

    天然和非還原樣品問題：

    有些抗體只能識別的表位是非連續氨基酸，這些氨基酸雖然在蛋白質一級結構中彼此不連續，但是在空間結構中則是靠在一起的。這些抗體就只能識別靶蛋白的空間結構狀態（抗體說明書中會有特殊說明）。對于這些樣品，緩沖液和凝膠中就不能含有SDS,并且不能夠對蛋白進行加熱變性。

    有些抗體只能識別蛋白的非還原狀態如氧化狀態，對此類樣品，就需要將緩沖液和凝膠中的還原劑DTT和beta-巰基乙醇去除。

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