細(xì)胞技術(shù)專題：大鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
大鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)可以：（1）獲得大鼠視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞；（2）用于視神經(jīng)損傷修復(fù)研究；（3）用于少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)課題研究。
實(shí)驗(yàn)方法
- 牛血清培養(yǎng)法
| 實(shí)驗(yàn)方法原理 | 采用視神經(jīng)，DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長，并進(jìn)行免疫組織化學(xué)鑒定。 |
|---|---|
| 實(shí)驗(yàn)材料 |
Wistar大鼠 |
| 試劑、試劑盒 |
亞硒酸鈉 腐胺 轉(zhuǎn)鐵蛋白 胰島素 甲狀腺素 黃體酮 谷氨酰胺 小牛血清 兔抗鼠GC抗體 |
| 儀器、耗材 |
眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱 |
| 實(shí)驗(yàn)步驟 |
一、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 取新生2 d 的Wistar大鼠10 只，無菌條件下取出雙側(cè)視神經(jīng)。
2. 接種至24孔培養(yǎng)板內(nèi)經(jīng)多聚賴氨酸處理的蓋玻片上。
3. 加入含30g·L-1 小牛血清的DMEM/F12 培養(yǎng)基，37°C，50mL/L CO2，100%濕度連續(xù)培養(yǎng)3 d 。
4. 3 d 后棄廢液，改為含 5g·L-1 小牛血清DMEM/F12 條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。
5. 每周換液2次。在獲得足夠的細(xì)胞數(shù)量后，改用無血清條件培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d 換液一次。 二、形態(tài)學(xué)觀察 每天在倒置顯微鏡，觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程和形態(tài)學(xué)變化并拍照。 三、免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定 1. 將含細(xì)胞蓋玻片取出，0.01 mol·L-1 PBS沖洗3 次×5 min。 2. 冷丙酮固定10 min。 3. PBS沖洗(3 次×5 min)。 4. 30g·L-1 過氧化氫室溫孵育15 min。 5. PBS沖洗3 次×5 min。 6. 滴加正常山羊血清，室溫孵育20 min。 7. 滴加1:100 GC抗體，陰性對(duì)照以PBS代替一抗，37°C孵育60 min。 8. PBS沖洗3 次×5 min。 9. 滴加 生物素標(biāo)記羊抗兔IgG，37°C，20 min。 10. PBS沖洗3 次×5 min。 11. 滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液。 12. DAB工作 液顯色，自來水終止反應(yīng)。 13. 脫水，透明，DPX封片保存。 四、結(jié)果 1. 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果
組織塊24 h 開始貼壁，48～72 h 可見神經(jīng)組織邊緣游出少量細(xì)胞，主要為圓形或梭形(圖 1)。8～9 d 左右，細(xì)胞基本鋪滿培養(yǎng)孔。此時(shí)改用無血清條件培養(yǎng)基培養(yǎng)進(jìn)行純化。培養(yǎng)過程中，部分細(xì)胞死亡。12 d 左右獲得的細(xì)胞胞體基本為呈圓形或多角型，直徑約 6～10 µm。細(xì)胞核較大，胞質(zhì)少(圖 2)。 2. 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 培養(yǎng)的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色 GC 蛋白陽性，未加一抗的呈陰性。染色結(jié)果顯示成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞突起豐富，互相形成蜘蛛網(wǎng)狀(圖 3)。蘇木素復(fù)染，異質(zhì)細(xì)胞較少，90%以上為陽性細(xì)胞(圖 4)。  Figure 1 Cells migrated from optic nerve tissue at the third day (10×10)
圖 1. 培養(yǎng)第 3 天，細(xì)胞自視神經(jīng)遷出 (10×10)
 Figure2 Purified oligodendrocytes of optic nerve at the fifteenth day (10×40)
圖 2. 培養(yǎng)第 15 天，純化的視神經(jīng)少突膠質(zhì)細(xì)胞(10×40)  Figure 3Positive expression of GC in oligodendrocytes at the seventh day (10×20)
圖 3. 培養(yǎng)第 7 天，少突膠質(zhì)細(xì)胞 GC 陽性表達(dá) (10×20)  Figure 4 Positive expression of GC in purified oligodendrocytes at the fifteenth day (hematoxylin staining) (10×20)
圖 4. 培養(yǎng)第 15 天，純化的少突膠質(zhì)細(xì)胞 GC 陽性表達(dá)(蘇木素復(fù)染)(10×20)
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| 其他 |
一、討論 抑制神經(jīng)再生基因Nogo的發(fā)現(xiàn)為視神經(jīng)損傷的修復(fù)、視功能保護(hù)研究帶來了希望。視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞包括星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞2 種類型，分化不同，功能各異。成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞不再具有分裂增殖能力，為分裂終期細(xì)胞[1]，培養(yǎng)較為困難。
1980 年McCarthy[2]等建立了從腦灰質(zhì)組織分離、純化星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)模型。目前國內(nèi)外多采用該法[3]。利用少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁能力的不同采用振動(dòng)分離法進(jìn)行分離、培養(yǎng)。此法主要用來獲取星形膠質(zhì)細(xì)胞，獲得的少突膠質(zhì)細(xì)胞較少。存在著操作步驟多容易被污染、分離過程中因振蕩離心易造成機(jī)械性損傷導(dǎo)致細(xì)胞死亡等缺點(diǎn)。
本實(shí)驗(yàn)采用視神經(jīng)組織塊培養(yǎng)的方法，對(duì)新生大鼠的視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行條件化原代培養(yǎng)，利用少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞生長條件的不同，采用條件培養(yǎng)基純化2 種細(xì)胞。
少突膠質(zhì)細(xì)胞和Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞是從一種普通雙潛能的少突膠質(zhì)細(xì)胞－2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞發(fā)育而來[1]。
大鼠出生后約1 周，少突膠質(zhì)細(xì)胞逐漸成熟。
因此，從新生大鼠取材可獲得O2A祖細(xì)胞。
體外研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腐胺、黃體酮和微量元素硒等，可使O2A 祖細(xì)胞朝少突膠質(zhì)細(xì)胞定向分化。
而血清等可以誘導(dǎo)O2A祖細(xì)胞分化為Ⅱ型星形膠質(zhì)細(xì)胞[1、4]。
我們利用這一特點(diǎn)，逐步減少條件培養(yǎng)基中的血清濃度，促進(jìn)O2A祖細(xì)胞向少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。
最終采用無血清條件培養(yǎng)基，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞及其它異質(zhì)細(xì)胞增殖，而少突膠質(zhì)細(xì)胞在此條件下則基本不受影響。
GC是表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞膜以及髓鞘的一種主要類脂，它是識(shí)別少突膠質(zhì)細(xì)胞普遍應(yīng)用的特異性化學(xué)標(biāo)志物[1、3]。
免疫染色鑒定結(jié)果表明純度較高超過 90%。此方法簡便、可靠、易于推廣，便于對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞相關(guān)課題進(jìn)行研究。 二、文獻(xiàn) 1. 何平，沈馨亞. 少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的研究進(jìn)展[J],神經(jīng)解剖學(xué)雜志 ,2000,16(2)：183-188.
2. McCarthy K D, DeVellis J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglia cell cultures from rat cerebral tissue [J], J Cell Biol 1980,85: 890-902. 3. 伍亞民,馬海涵,廖維宏. 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的純化培養(yǎng)與鑒定[J],創(chuàng)傷外科學(xué) 2000,4：207-209. 4. Raff MC, Miller RH, Noble M. A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium [J],Nature 1983,303(5916): 390-6. |
標(biāo)簽：
大鼠
膠質(zhì)細(xì)胞
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