正常人甲狀腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法
正常人甲狀腺細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法
實(shí)驗(yàn)材料：
1. 甲狀腺細(xì)胞材料來源：人孤立性良性甲狀腺腺瘤旁邊正常組織、甲狀腺功能亢進(jìn)甲狀腺組織或甲狀腺腫瘤組織均可作為研究的材料；
2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；
3. 培養(yǎng)用液：DMEM培養(yǎng)液，含15%—20%小牛血清、0.6mmol/L的HEPES、12.5mmol/L的谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。用5.6%的NaHCO3溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0左右；
4. 消化液：0.25%胰蛋白酶溶液；
5. 培養(yǎng)器具：培養(yǎng)瓶或皿、孔徑為100μm的不銹鋼網(wǎng)篩、眼科剪、鑷子等；
培養(yǎng)方法：
1．將所取材料放入加有PBS的無菌容器中，立即送至培養(yǎng)室，時(shí)間不超過30min。若不能立即培養(yǎng)，可放在培養(yǎng)液站，置4℃下保存，但時(shí)間不炒股4h為宜；
2．在無菌條件下，將組織移至平皿內(nèi)，用PBS洗滌2—3次。用眼科鑷剝離去除被膜及結(jié)締組織，并擠壓出其中的血液成分；
3．用眼科剪將組織剪成1mm3大小的勻漿狀，移入瓶內(nèi)。加入比細(xì)胞多5—10倍量的消化液，于37℃水浴條件下消化30—60min。每隔5—10min搖動1次；
4．消化完畢，加入冷的PBS終止消化。通過孔徑100μm的不銹鋼網(wǎng)篩過濾。收集濾液于離心管中，以1500r/min離心10min。吸去上清液，將細(xì)胞沉淀再用PBS漂洗2次。離心棄上清液。收集未通過篩網(wǎng)的組織，加消化液置37℃水浴條件下繼續(xù)消化15—30min，并過篩合并。在漂洗后的細(xì)胞沉淀中加入一定量的培養(yǎng)液，用吸管吹打數(shù)次，制成細(xì)胞懸液；
5．吸取少量細(xì)胞懸液，加入臺盼藍(lán)染液，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)。活細(xì)胞比例應(yīng)大于90%。用培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞至密度為5×105—10×105個(gè)/ml；
6．接種細(xì)胞懸液到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中。于37℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
7．次日，吸出培養(yǎng)液以去掉未貼壁的細(xì)胞，加入新鮮培養(yǎng)液，以后每隔3—5天換液1次；
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