Yu 2004.11.09

     血清脂蛋白是由血液中脂質與某些特異的蛋白質組成的一類不均一的復合物。因其所含脂與載脂蛋白的比例不同，其密度范圍在0.96g/ml(或更低)到1.21g/ml之間。紙電泳中顯示四條帶，即：乳密微粒，極低密度脂蛋白（VLDL,也稱前β脂蛋白），低密度脂蛋（LDL，也稱β脂蛋白），高密度脂蛋白（HDL，也稱α脂蛋白）。每種脂蛋白還可以分為更多的亞組分。

 

    用電泳法分離含載脂蛋白較高的組份（HDL，VHDL）比較成功，而離心分離法則適合用于各種密度的血清脂蛋白分離。

 

1梯度材料：

 

血清脂蛋白密度較低，常用的梯度材料為Nacl,NaI,Kbr,KI等，常用的緩沖劑為EDTA。

 

表一 常用梯度材料的配置及密度（20°C）

名稱	配置	密度（g/ml）
Nacl	0.196 mol/L	1.006
NaBr	0.804 mol/L	1.063
NaBr	2.705 mol/L	1.21
KBr	0.747 mol/L	1.063
KBr	1.496 mol/L	1.21
NaCl+KBr+EDTA	153gNaCl+354gKBr+10ml 0. 2mol/L EDTA+水至總量1000ml	1.35
NaCl,NaBr A液:200gNaCl+800ml水 B液:400gNaBr+600ml水 C液:11.14gNaCl+788.6ml水(ρ=1.006g/ml)	10ml A液+31.7mlB液 10ml A液+15.6mlB液 10ml C液+2ml 1.35液 4ml C液+6ml 1.35液	1.35   1.31     1.063     1.21

 

2預分離：

 

2.1血細胞與血清分離：

　　離心參數：全血，角轉頭，3000rpm×20min

　　結果：沉淀為血細胞，上部為血清。

 

2.2乳糜粒分離：禁食12小時以上人血漿中乳糜粒含量極少，已進食者因其血漿含乳糜粒高，應先離心去除乳糜粒。

　　離心參數：4 ×10⁶ (g×min),10°C，各種轉頭轉速均可。

　　梯度液配置：離心管下部3/4容積加血漿，上部1/4容積加0.15 mol/L NaCl+ 0.3 mol/L EDTA,pH7.4

　　結果：乳糜粒上浮，吸出。

 

2.3血清蛋白分離：除去球蛋白、白蛋白及其它蛋白質。

　　離心參數：（2.5-3）×10⁶(g×hr), 各種轉頭均可。如角轉頭70000rpm× 6hrs,10℃

　　配置：管容量1/3為血清，2/3為1.31g/ml,NaCl+NaBr,攪拌后終密度為1.21g/ml

　　結果：管上部1/6容積為血清脂蛋白，下部5/6為其他蛋白。

 

3方法：

 

3.1順序浮選法：

　 3.1.1超速法：最早使用的方法，40000rpm×24hrs×3次，10℃

NaCl+NaBr梯度按1.006，1.063，1.21順序浮選，每次在管上部取出不同密度之脂蛋白。操作簡單，分辨率高，得率高，費時，成本高。

　　3.1.2超高速法：100000rpm×2.5hrs×2次，10℃, 100000rpm×4hrs×1次，NaCl+KBr+EDTA梯度按不含密度浮選出VLDL，LDL，HDL

 

3.2單次離心法：

 

3.2.1單次甩平分離

 

用最高轉速為25000~28000 rpm,6×40ml甩平轉頭以1.006g/ml NaCl液及1.35g/ml(NaCl+KBr+EDTA)液配置成從 1.006至1.21的8層不連續階梯度，最下部用血清與KBr配成1.25g/ml樣品液，25000rpm×4hrs,4℃一次得到VLDL，LDL，HDL不同層區帶。

 

用最高轉速為40000 rpm, 6×13ml甩平轉頭，40000 rpm×24hrs，20℃，不連續KBr梯度1.006~1.21g/ml,細長管，分層清晰，回收率高，離心時間長

 

3.2.2單次垂直管分離：

 

NaCl/KBr或NaCl/NaBr不連續梯度單管容量從5ml到40ml，轉速從50000 rpm~80000 rpm，離心（0.5-3）hrs,下層用KBr或（NaBr）將血清調至1.3g/ml上層用1.006g/ml,NaCl液，10℃-20℃，增加，減速一次分出。

 

NaCl/蔗糖不連續梯度下層為48%W/W蔗糖,中層血清在4mol/L NaCl中，上層為0.67M NaCl+0.05% EDTA,離心參數同上，時間較長。

 

3.2.3區帶轉頭大容量分離：

 

離心參數：區帶轉頭，最高轉速30000~48000rpm, 容量從650ml~1900ml,每次可分離血清50-150ml,低速加樣及卸載，分離轉速：大轉頭（25000-28000rpm）×2hrs，小轉頭（30,000-38,000rpm）×1hrs，10℃-20℃

 

梯度液：(NaCl+NaBr或KBr)+EDTA不連續或線性梯度，樣品在最大密度層，近轉頭核心處用純水做隔離層，分離室最外部用高密度NaCl/KBr或NaCl/NaBr作緩沖層。

 

收集：泵出后依此經帶流動地的紫外檢測儀檢測，自動部分收集器收集。

 

4討論：

 

1、用以上方法分離的VLDL，LDL，MDL，還可以進一步用長離心管縮小不連續梯度密度差，分離出其亞組份。

 

2、實驗質量很大程度上取決于密度標定，配置后可用密度劑或折射儀校核。

 

3、超分析超離心法可精確分離微量血清脂蛋白，并可測定各種組份（包括其亞組份）的上浮系數Sf。

 

作者：余興明   電話：13764301893,yuxingming@techcomp.cn