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正常小鼠原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

瀏覽次數(shù):2205 發(fā)布日期:2010-6-12  來源:www.pricells.com.cn
 
PriCells –正常小鼠原代腦星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)
 
一、實驗試劑
 
1、培養(yǎng)基: PriCells Medium + 10% FBS + 1% P/S + PriCells Supplement
2、凍存液: PriCells Medium + 20% FBS + 10% DMSO
3、洗滌液: 1 × PBS (pH 7.4 )+ 1% P/S
4、染色液: 0.4% Trypan Blue
5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit
6、檢測試劑:抗小鼠CD 11b/c抗體,熒光標(biāo)記二抗,乙醇丙酮混合液(1:1)
 
二、實驗器械
 
1、培養(yǎng)皿
2、培養(yǎng)瓶
3、直剪和眼科剪
4、眼科鑷和止血鉗
5、10ml注射器
6、玻璃滴管
7、燒杯
8、15ml離心管
 
三、實驗流程
取材
去除大腦腦膜及血管,剔除海馬部分
1 × PBS (pH 7.4 )漂洗3次,去掉表層血絲
先用眼科鑷將組織撕碎成糜狀,用眼科剪反復(fù)剪10min,再用移液器輕輕吹打20~30次。
將組織轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,加入消化液(PriCells)
將離心管放置到37℃,15-20min水浴恒溫消化
加入消化終止液(PriCells)終止反應(yīng)
離心,1000rmp,10min,棄去上清
重懸,計數(shù)細(xì)胞
接種密度以1 × 106個/ml
培養(yǎng)37℃,5%CO2
 
四、實驗操作
 
1、培養(yǎng)瓶預(yù)包被。試驗前一天預(yù)包培養(yǎng)瓶,置于超靜臺吹干或45℃烘箱烘干(切記保持無菌),4℃冰箱放置,備用。
 
2、取材:正常昆明小鼠(生后24h內(nèi))。
 
3、材料預(yù)處理:將小鼠處死后浸泡入體積分?jǐn)?shù)75% 乙醇中消毒,以血管鉗從后夾住頸部,用眼科剪從枕部向前依次分開頭皮及顱骨,再用眼科鑷依次剝離,剔除腦膜及血管。取大腦(剔除海馬部分)置于1 × PBS (pH 7.4 )中,漂洗去表層血絲,至腦組織呈乳白色。
 
4、消化液:用眼科鑷將組織撕碎成糜狀,再用眼科剪反復(fù)剪10min,最后再用移液槍輕輕吹打20~30次,將剪碎的組織用槍轉(zhuǎn)移至15ml離心管中,37℃水浴消化15min。
 
5、終止消化:按1:1加入消化終止液,中止酶反應(yīng)。
 
6、收集重懸細(xì)胞:1000 rpm,離心10 min,棄去上清,加入培養(yǎng)液重懸,染色計數(shù)細(xì)胞。
 
7、培養(yǎng)細(xì)胞密度:調(diào)整細(xì)胞密度以1 × 106個/ml 接種入培養(yǎng)瓶。
 
8、培養(yǎng):放置于37℃,5% CO2培養(yǎng)箱中。
 
五、細(xì)胞鑒定
 
1、顯微鑒定:相差顯微鏡下,可見細(xì)胞呈星形狀,細(xì)胞密度增高后呈現(xiàn)鵝卵石樣鑲嵌排列,有接觸抑制的特點。細(xì)胞具備良好的透光性。
 
2、免疫組織化學(xué)鑒定 :利用OX-42 (CD 11b/c)免疫熒光染色。
 
3、細(xì)胞爬片。將洗凈的蓋玻片放入6孔培養(yǎng)板中,接種細(xì)胞為3×104個/孔,48小時候細(xì)胞可以長滿,用鑷子取出鋪滿細(xì)胞的蓋玻片備用。
 
4、細(xì)胞固定:用PBS洗滌細(xì)胞,之后放入乙醇丙酮混合液中,固定10min,空氣中自然干燥。
 
5、特異性抗體:按照說明書稀釋比要求稀釋抗體,加入抗體,放置37℃孵育60min。
 
6、洗滌:1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次 × 15 分鐘,晾干。
 
7、標(biāo)記性抗體:加入熒光標(biāo)記抗體,37℃孵育30min。
洗滌:1 × PBS (pH 7.4 )洗滌3次 × 15 分鐘,晾干。
 
8、封片:封片劑封片。
 
9、鏡檢:熒光顯微鏡下觀察,膠質(zhì)細(xì)胞包質(zhì)呈現(xiàn)較強(qiáng)黃綠色熒光,細(xì)胞核周圍尤其明顯。
 
六、注意事項
 
1、選材注意選取新生昆明小鼠(24h內(nèi))。取材過程盡可能保證無菌,盡量剔除腦膜及血管和海馬部分。
 
2、注意盡可能消除腦組織表面的殘血,避免血細(xì)胞及某些血清成分對膠質(zhì)細(xì)胞貼壁的影響。
 
3、膠質(zhì)細(xì)胞分離損傷嚴(yán)重影響膠質(zhì)細(xì)胞的生長,因此應(yīng)嚴(yán)格掌握好酶的消化濃度和消化時間。
 
4、嚴(yán)格控制膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)條件。包括細(xì)胞培養(yǎng)用液(培養(yǎng)基,生長因子,血清,抗生素)的質(zhì)量,濃度。
 
5、關(guān)于培養(yǎng)瓶包被與否,有文獻(xiàn)研究顯示包被與未包被之間沒有特別大的差異。 實驗中,可以酌情考慮是否包被。
 
6、傳代培養(yǎng)細(xì)胞接種量為1×106個(25 cm2培養(yǎng)瓶),細(xì)胞倍增時間為36小時。細(xì)胞傳代培養(yǎng)最佳為5-8代, 傳代次數(shù)增加,細(xì)胞體積增大,細(xì)胞之間間隙增加,細(xì)胞貼壁牢固,傳代消化時間會有所延長。
 
七、PriCells細(xì)胞圖片
發(fā)布者:武漢原生原代生物醫(yī)藥科技有限公司
聯(lián)系電話:027-87490190
E-mail:service@pricells.com.cn

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