【摘要】
目的：探討ATP發光技術快速檢測菌落總數的可行性。方法比較ATP生物發光值與平板計數法對細菌總數進行檢測。
結果：檢測結果相關性研究分析表明，兩者在一定范圍內具有顯著相關性。
結論：ATP生物發光法操作簡便，應用范圍廣，可應用于對食品中菌落總數的快速檢測。

 

 

菌落總數是食品微生物國標檢測中的一個重要指標，主要是作為判定食品被細菌污染程度的標志。在國家頒發的食品衛生標準和進口貿易中許多食品的衛生指標都有菌落總數的限量規定。常規的菌落總數檢驗方法(平板計數法)存在操作繁瑣、測試周期較長及檢測結果在實際生產的質量控制中意義不大等問題。ATP生物發光測定法是快速檢測微生物的方法之一。本文對ATP生物發光測定法與平板計數法的相關性進行了研究分析，并對ATP生物發光測定法進行衛生學檢測的可行性和可操作性進行探討。

 

1．1儀器與試劑
ATP生物發光快速檢測系統配套儀器及試劑(沈陽中科靚馬生物工程有限公司生產)，包括：濱松9505微量光度計、專用比色杯、發光反應試劑(LLR)、細菌細胞ATP釋放試劑(XRA)。旋渦混合器。稀釋用磷酸鹽緩沖液(PBS)9ml試管分裝10管(121℃高溫高壓滅菌)。固體營養瓊脂培養基(121℃高溫高壓滅菌)。PE手套。大腸桿菌(ATCC25922—3，購于中國藥品與生物制品檢定所)。恒溫搖床。臺式離心機。

 

1．2．1實驗準備
計數前1天，用接種環刮取大腸桿菌斜面培養物一環接種到裝有40mlLB的100ml三角瓶內，37℃振蕩培養過夜。取上述培養物離心(10000r／min，1min)倒去上清液，沉淀用等體積PBS洗滌1次，用同樣體積PBS懸浮，此即培養物原液。稀釋：(假定培養物濃度約為1×10⁶ cell／m1)用PBS將培養物做10倍遞增稀釋。

 

1．2．2平板計數
確定3個用于平皿計數的稀釋梯度，保證至少1個梯度的計數在30～300范圍內，吸取1ml加人到玻璃滅菌空培養皿中，每個梯度平行倒兩個平板，同時做空白對照。于37℃溫箱培養48h計數。選擇菌落計數在30～300范圍內均勻分散的釋梯度作平板計數并取其平均值。

 

1．2．3 ATP測光
提前打開微量光度計屏幕顯示RLU為“0”，用滅菌的移液管尖吸取50待測菌液，加入專用比色杯中。將比色杯放人微量光度計抽屜，手持XRA試劑瓶，向比色杯底垂直滴加兩滿滴XRA。用滅菌的100µl移液管尖，將50µl LLR加入杯中，和緩地吸擠3次，混勻反應液。保持抽吸時間、次數一致。并力求所有樣品的這段操作時間一致。關上微量光度計抽屜，此時微量光度計自動進行熒光值測量，等微量光度計顯示出熒光值后記錄熒光值的大小。

 

2．1 ATP測定法與平板計數法試驗結果
兩種方法測定細菌總數的兩次平行試驗結果見表1、表2。

2．2 ATP測定法與平板計數法相關性
依據表1、表2數據，以光值平均數的對數值為Y軸，平板計數平均數對數值為x軸，作x、Y散點圖描繪關系曲線，Y=0.8834x—1.6807，R²=0．9778。從數據和散點可以看出，第一次試驗的1O一、第二次試驗的10^-5、10 ^-6 3個梯度的值與其他值線性較差，在檢測限以外。可以看出，在細菌數量10 cfu／ml以上范圍內平板計數與生物發光值成顯著相關。

 

ATP生物發光法檢測靈敏度高，試驗中發現受試液顏色、操作及非細菌ATP對發光強度均有影響，但對總體發光強度的影響都<0．9％。從待測樣品的制備到細菌ATP的提取，直到ATP發光強度的檢測，整個過程可在lh內完成，具有快速、簡便的特點，可以滿足一般快速檢測的要求。ATP發光技術能達到的檢測極限為l0^-15 molATP，相應的細菌總數應在10³ cfu／ml以上，樣品衛生指標標準在10³ cfu／ml以上的可即時得出樣品細菌總數數量判斷質量好壞。而微生物檢驗衛生指標在10³ cfu／ml以下，可采用適當簡便的富集技術，使樣品菌落總數達到有效檢測范圍，而該技術也是ATP發光技術能應用于衛生檢驗的關鍵。近年來，蟲熒光素酶已通過基因工程生產，價格大幅度減低，隨著相關儀器的小型化，ATP生物發光技術必將會在國內相關行業得到迅速普及。

（馬妮 趙虹 中國衛生工程學）