內毒素是革蘭氏陰性菌的細胞外壁層上的特有結構，又名脂多糖（LPS）。LPS成分進入人體血液后，內毒素大量聚集于血液中，超過機體系統的清除能力，會導致內毒素毒性效應，即熱原反應，包括發熱、腹瀉、嘔吐，以及致命的內毒素休克。
 

由于內毒素是革蘭氏陰性菌死亡或粘附與其他細菌時細胞壁破碎或溶解所產生的，其本身又具有耐熱性和穩定性，通過高壓蒸汽處理也不能完全使內毒素滅活，因此內毒素在各種溶液中及接觸水溶液的器壁上都是存在的。
 

而在制藥行業，特別是注射用藥，對細菌內毒素進行可靠和有效的檢測是重要環節。標記為無熱原或無菌的注射或植入產品必須進行內毒素檢測放行。許多原材料檢查也必須進行內毒素檢測方能用于GMP生產，以達到設計標準的質量要求。
 

重組C因子檢測內毒素優越性和適應性

在醫學上，鱟的珍貴藍色血液價值極大鱟的血液含有一種特殊的免疫細胞——“阿米巴樣細胞”。這種細胞對細菌非常敏感，遇到含有使人發熱、休克甚至死亡的細菌類毒素會立即凝固或者變色，科學家們根據這種特性研究制造出了鱟試劑，使其成為了世界醫療衛生領域檢測細菌內毒素的標準方法，并逐步被收載于藥典。根據鱟血來源不同，一般分為LAL（美洲鱟試劑）/TAL（東方鱟鱟試劑）。
 

隨著我們對鱟試劑的需求越來越多，而鱟試劑的生產原料鱟和鱟血卻越來越少。與此同時鱟試劑還存在除了能與內毒素反應外，還會與(1-3)-β-D-葡聚糖反應，造成假陽性結果，存在非特異性干擾，以及批次穩定性問題。為了實現細菌內毒素檢測的可持續發展，科學家進行了微量化以及替代方法的研究。
 

根據鱟試驗反應原理，目前行業內已經建立了四種主要的細菌內毒素檢測方法：凝膠法、濁度法、顯色法和重組C因子（rFC法），并在非腸道藥物和注射器械生產過程控制和產品放行質控檢測中有著重要的應用。
 

濁度法、顯色法和重組C因子法是定量方法，凝膠法為定性或者半定量方法。濁度法、顯色法和凝膠法依賴于鱟血，隨著基因工程技術的發展，出于對鱟資源的保護，重組C因子法更具有適用性。
 

C因子是鱟試劑中對細菌內毒素敏感的蛋白，能夠選擇性識別內毒素。重組C因子是一種人工合成的C因子，它被細菌內毒素活化后，可與熒光底物作用產生與內毒素濃度成比例的熒光信號。
 

2003年，Jeak Ling Ding等酵母重組表達C因子，Lonza公司得到了該生產工藝的授權，并商業化了產品PyroGene重組C因子內毒素檢測試劑盒，用于鱟試劑內毒素檢測方法的有力補充。此外，半個世紀以來，Lonza擁有包括細菌內毒素檢測試劑盒、內毒素檢測軟件、全自動內毒素檢測儀器在內的一站式解決方案，符合FDA 21 CFR part 11和歐盟EU GMP 附錄11法規要求，以服務于各類細胞制劑生產企業、制藥企業質控部門，可植入醫療設備和透析樣品質控以及科研院所等相關機構，其服務對象覆蓋70%的制藥100強企業，已用于國外大量藥物的放行上市，滿足出口型制藥企業的規模化熱原測定需求。
 

重組C因子內毒素檢測法具有更高的特異性，更好的專屬性、精密度、準確度、線性范圍及定量限，是目前鱟試劑內毒素檢測方法的改良方法。重組C因子不依賴動物源性成分，提供更高的供應安全性，重組表達生產，產品批間一致性良好，終點熒光測定，與其他定量鱟試劑方法相當。
 

此外，由于內毒素特異性，重組技術消除了鱟試劑中β-1,3-葡聚糖對檢測結果的干擾，避免潛在假陽性的產生。由于重組C因子可替代傳統鱟試劑的優勢，重組C因子被逐步推廣。
 

目前，重組C因子已得到各國法規的認可，各國藥典相繼引入重組c因子。其中歐洲藥典明確表明重組c因子可用于內毒素檢測，并正式寫入2.6.32章節，美國和日本藥典均已將重組c因子引入至對應指導原則章節。中國藥典2020版也在“<9251>細菌內毒素檢查法指導原則”中正式體現。
 

近期，Lonza應美國藥典 (USP)的請求研發了一組數據集，用于美國藥典正式納入重組C因子內毒素檢測法的數據需求。
 

本期醫直播課堂邀請到Lonza全球專家Allen L. Burgenson，將在2022年04月19日（星期二）19:30-20:30上線一場主題為“不同內毒素檢測方法在四種典型非腸道藥物中的測定比較”的線上直播課程，全球專家Allen L. Burgenson將向中國聽眾分享這些最新的數據。

直播課堂

直播題目：不同內毒素檢測方法在四種典型非腸道藥物中的測定比較

直播時間：2022年04月19日 19:30到20:30

課程主題：

➤ 是否可以使用 LAL 和重組方法檢測來自本土細菌的內毒素？

➤carbon bed處理后的水樣品中是否存在葡聚糖？

➤ 如何使用 LAL 和重組方法測量最終產品中的內毒素

➤ 濁度法、顯色法、重組rFC法之間的異同點

中英雙語PPT，問答環節有翻譯，內容精彩，歡迎報名參加！