研究背景
    乳腺癌是世界范圍內女性最常見疾病，目前乳腺癌治療會結合手術和多種輔助治療手段。然而在乳腺癌治療中，化療藥物耐藥是治療一大障礙。因此深度理解藥物抵抗、代謝機制實施個性化藥物治療非常重要。吉西他濱(Gemcitabine; 20,20-difluorodeoxycytidine, dFdC)是FDA批準的治療后復發(fā)或轉移病人以及蒽環(huán)霉素輔佐化療失敗病人的一線藥物。90%以上吉西他濱服用都是由胞苷脫氨酶將其轉化為2’-deoxy-2’,2’-difluorouridine (dFdU)導致失活。最近研究表明吉他西濱代謝通路中的基因與吉他西濱藥物抵抗相關。另外，有研究表明，miRNA在化療藥物抵抗過程中起著關鍵作用。然而，乳腺癌中吉他西濱藥物抵抗?jié)撛诘姆肿訖C制尚未闡述清楚。該研究中miRNA芯片（Agilent Technology, Austin, TX）以及mRNA芯片（Affymetrix, Santa Clara, CA）服務由上海伯豪生物完成。

研究結果

1. 吉西他濱抗性細胞構建及其性質描述

   為了揭示吉西他濱在乳腺癌中抗藥性的分子進化機制，研究者通過將MDA-231細胞系暴露于12個逐漸增加吉西他濱藥物濃度產生出了吉西他濱抗藥細胞系MDA-231-Germ。MDA-231-Germ 的IC50值比親代細胞系MDA-231高9倍。用吉西他濱治療時MDA-231-Germ克隆細胞數(shù)目也顯著高于MDA-231。為了研究吉西他濱抗性基因，分別對親代細胞以及耐藥性細胞用芯片技術獲得mRNA表達譜，并進行GO富集分析發(fā)現(xiàn)激活的通路都與藥物代謝相關。以上結果說明研究者已經成功建立了吉西他濱抗性細胞系MDA-231-Gem cells。

2. 提高CDA表達能夠促進乳腺癌細胞吉西他濱耐藥性

    基于以上mRNA表達譜芯片分析發(fā)現(xiàn)一些重要的吉西他濱代謝酶主要集中于一個代謝通路中。其中能夠通過脫氨基作用失活吉西他濱的CDA在MDA-231-Gem細胞中上調。此外，CDA在MDA-231和MDA-436表達，但是在MCF7, ZR-75-30 ,MDA-468, and Hs-578T細胞系中幾乎不表達。而與芯片分析結果一致，CDA在MDA-231-Germ與其他細胞系相比高表達。細胞毒性實驗表明，過表達CDA的乳腺癌細胞系具有更高的IC50值。抑制CDA表達能夠降低乳腺癌細胞系對吉西他濱的藥物抗性。以上結果表明CDA表達與乳腺癌細胞系對于吉西他濱治療敏感性非常相關。

3. CDA抑制乳腺細胞增殖導致細胞循環(huán)重分配

   細胞增殖實驗表明CDA表達量高的MDA-231-Gem細胞比其親代細胞增殖速率慢。CDA過表達能夠抑制MDA-231和MCF-7細胞增殖，CDA抑制能夠促進MDA-231細胞增殖。因此，可以得出結論CDA能夠抑制乳腺細胞增殖。由于CDA在嘧啶轉換為尿苷過程其重要調控作用，因此可能會影響核酸池平衡致使復制速率減慢。因此通過檢測細胞周期分布發(fā)現(xiàn)S期細胞比例在MDA-231-Gem中比親代細胞明顯增加。在MDA-231和MCF-7導入外源性CDA導致S期細胞比例增加。當在MDA-231-Gem導入CDA靶向的shRNA，S期富集現(xiàn)象逆轉。以上結果表明CDA在調控細胞周期重分布以及復制過程發(fā)揮重要作用。

4. Cyclin E–CDK2復合物及其相關分子參與CDA介導的細胞周期重分布

   Cyclin E–CDK2在控制G1-S細胞周期中起到重要作用，因此本文用Western blot實驗分析cyclin E–CDK2 complex，當CDA在MDA-231-Germ中高表達時cyclin E和CDK2下調。而沉默CDA，cyclin E–CDK2復合物表達增加。與cyclin E類似cyclin A表達也與CDA呈相反趨勢。cyclin E–CDK2復合物會導致Rb磷酸化不能與轉錄因子E2F結合使下游基因轉錄度過G1-S期。磷酸化Rb，Rb表達以及E2F表達與cyclin E–CDK2復合物類似說明CDA水平可能會降低cyclin E–CDK2復合物表達抑制下游通路活性。以上結果說明cyclin E–CDK2復合物以及其相關的分子參與了CDA誘導的細胞周期重分布。

5. miR484作為轉錄后調控子下調CDA表達

   首先本研究采用多種算法預測CDA的靶基因，得到34個候選miRNA至少被四個算法預測到。34個候選miRNA中有3個在MDA-231-Gem和親代細胞差異表達。熒光素酶報告試驗證實三個miRNA可以和CDA結合。western blot發(fā)現(xiàn)miR-484能有效抑制CDA表達。3個miRNA中只有miR-484與CDA表達顯著負相關。以上實驗說明miR-484可能通過直接靶向CDA 3’-UTR使其表達下調。

6. miR-484/CDA調節(jié)乳腺癌細胞吉西他濱抗性、細胞增殖以及細胞周期重分布

   以上結果表明CDA可能是miR-484靶基因，為了進一步驗證，過表達miR-484能夠引起CDA表達下降，其所表現(xiàn)出的結果和引入shRNA類似。進一步，如果CDA是miR-484靶基因，那么在miR-484表達的細胞中引入CDA應該可以抵消miR-484引起的表型。結果正如預料的一樣，說明miR-484能夠靶向CDA調控下游通路。

7. CDA表達可作為乳腺癌預后marker

   qPCR對30對樣本檢測，發(fā)現(xiàn)原發(fā)性乳腺癌比其配對癌旁中CDA表達頻繁顯著下調，而miR-484剛好相反。對193原發(fā)乳腺癌樣本和36非癌control用IHC檢測CDA蛋白水平發(fā)現(xiàn)CDA在94.4%非癌組織中有很強的信號，而在原發(fā)腫瘤中比例有所降低（40%）。此外，臨床特征分析表明CDA與乳腺癌ER狀態(tài)強烈相關。KM分析表明高CDA表達與長的DFS（disease-free survival）顯著相關。此外，CDA高表達使乳腺癌復發(fā)風險降低。以上結果表明CDA表達水平可以作為乳腺癌的預后marker。

研究結論

   本研究闡述了乳腺癌吉西他濱抗藥性的分子機制以及乳腺癌細胞中miR-484/CDA可以調節(jié)細胞周期。闡述了miR-484調控CDA在調節(jié)吉西他濱抗性和細胞周期、細胞增殖中的重要作用，且CDA可以作為乳腺癌預后的marker。

原文出處
Fu-Gui Ye,Chuan-Gui Song, Zhi-Gang Cao,Chen Xia, Dan-Na Chen, Li Chen, ShanLi, Feng Qiao, Hong Ling, Ling Yao, Xin Hu, and Zhi-Ming Shao. Cytidine Deaminase Axis Modulated by miR-484 Differentially Regulates Cell Proliferation and Chemoresistance in Breast Cancer. Cancer research 2015, 75, 1504-15.