來自蒙特利爾麥吉爾大學(xué)（McGill University）和魁北克基因創(chuàng)新中心（Génome Québec Innovation Centre ,MUGQIC）的JiannisRagoussis博士是乳腺癌研究領(lǐng)域最早實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞全外顯子組測序的科學(xué)家之一。長久以來，希臘人都以開拓者的形象聞名于世，Ragoussis博士也不例外，早在2013年他加入魁北克基因創(chuàng)新中心（MUGQIC）之前，就已經(jīng)在牛津大學(xué)的人類遺傳學(xué)威康信托中心（Wellcome Trust Centre for Human Genetics）做了11年研究，將已有的基因組學(xué)平臺(tái)發(fā)展成果與新引進(jìn)的二代測序技術(shù)進(jìn)行了有機(jī)結(jié)合。

 

 

在魁北克基因創(chuàng)新中心，Ragoussis博士率先采用Fluidigm的 C1系統(tǒng)制備單細(xì)胞全外顯子組測序樣本使二代測序達(dá)到了單個(gè)細(xì)胞測序的分辨率。他開創(chuàng)性地根據(jù)細(xì)胞多樣性進(jìn)行分類將癌癥的識(shí)別和消滅工作分成兩個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行，并且從最變幻莫測的乳腺癌開始研究。他的研究小組主要研究三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer），這是惡性程度最高的乳腺癌亞型之一，主要特點(diǎn)是預(yù)后很容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。由于缺乏表達(dá)雌激素、黃體酮和人表皮生長因子-2（HER2/neu）的受體，三陰性乳腺癌對標(biāo)準(zhǔn)的激素療法不敏感。傳統(tǒng)治療方法都只能針對這些受體中的一種進(jìn)行治療，所以三陰性乳腺癌的病例往往頗具挑戰(zhàn)性。

 

單細(xì)胞全外顯子組測序技術(shù)提供了一個(gè)獨(dú)特的視角來進(jìn)行癌細(xì)胞生物學(xué)研究，這是細(xì)胞群體樣本測序方法無法提供的。利用這一獨(dú)特的視角，Ragoussis博士得以在癌癥發(fā)生以及進(jìn)行治療的過程中對個(gè)體細(xì)胞群的突變譜（mutational profiles）進(jìn)行描述，并且可以追蹤它們隨時(shí)間是如何變化的。

 

單細(xì)胞全外顯子組測序技術(shù)對于攻克難治性（treatment-resistant）三陰性乳腺癌來說非常重要，Ragoussis博士說：“突變譜分析可以提供那些在治療后積累并促使癌細(xì)胞存活下來的變異信息。”

 

 

在早期使用C1系統(tǒng)新流程的的一次實(shí)驗(yàn)中，Ragoussis博士采用單細(xì)胞全外顯子組測序技術(shù)來檢驗(yàn)個(gè)體細(xì)胞群的異質(zhì)性。他解釋了項(xiàng)目進(jìn)行到此階段的兩個(gè)整體的目標(biāo)，“通過增加新的有意義的藥物靶標(biāo)來擴(kuò)充可能的藥物化合物庫，同時(shí)最大限度利用目前已有的化合物。”

 

Ragoussis博士的研究小組首先致力于將細(xì)胞們按照各自的突變譜進(jìn)行分組，這樣可以幫助他們確認(rèn)究竟存在多少種不同類別的突變譜以及評價(jià)是否可以將突變基因歸類到可提供致瘤線索的相關(guān)的網(wǎng)絡(luò)中。他補(bǔ)充說“先理解腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性以及腫瘤細(xì)胞在體外如何應(yīng)答對于預(yù)測什么物質(zhì)可能在體內(nèi)有效是十分重要的。”

 

在近期的一項(xiàng)預(yù)試驗(yàn)中，Ragoussis博士和同事們驗(yàn)證了這個(gè)工作流程并且確認(rèn)C1系統(tǒng)可以整合到他們已有的快速捕獲實(shí)驗(yàn)流程中。Ragoussis博士說：“Fluidigm的工作流程是迄今我們應(yīng)用的最令人振奮的技術(shù)成果之一。預(yù)試驗(yàn)證明了這種方法在我們研究中的高效性和可行性。”

 

采用新的工作流程產(chǎn)生了可靠的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，Ragoussis博士估計(jì)大約覆蓋了70% 細(xì)胞的全外顯子組。他的結(jié)論是：“這些數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)的細(xì)胞群體測序法所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是有可比性的。”

 

Ragoussis博士是與麥克吉爾大學(xué)Goodman癌癥研究中心（Goodman Cancer Research Centre）的主管Morag Park一起合作研究的。Morag Park的實(shí)驗(yàn)室通過外科手術(shù)創(chuàng)造出不同物種間組織移植的樣本，或者是在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生原發(fā)性乳腺癌的異種移植物。移植后這些癌細(xì)胞繼續(xù)保持原始腫瘤的復(fù)雜性進(jìn)行生長。

 

在用培養(yǎng)基培養(yǎng)異種移植物細(xì)胞后，研究小組利用C1系統(tǒng)進(jìn)行單細(xì)胞捕獲從而對全外顯子組進(jìn)行測序。迄今為止，科研人員們已經(jīng)對來自一個(gè)難治性腫瘤中的81個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了分類。

 

目前Ragoussis博士和他的研究小組已經(jīng)識(shí)別出腫瘤中所有的體細(xì)胞突變，他們正利用這些信息來定義錯(cuò)誤發(fā)生率（false discovery rate）以及確定一個(gè)特殊的突變在被界定成為真正具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的發(fā)現(xiàn)時(shí)需要被檢測到的次數(shù)。

 

接下來，科研人員們計(jì)劃利用單細(xì)胞外顯子組測序技術(shù)來闡明難治性產(chǎn)生的機(jī)制。Ragoussis博士希望結(jié)合單細(xì)胞全外顯子組測序的數(shù)據(jù)和已有的蛋白表達(dá)數(shù)據(jù)集創(chuàng)建出能夠分析體外治療效果的試驗(yàn)方法。從理論上來說這種方法可以幫助我們找到針對不同癌細(xì)胞類型患者的行之有效的個(gè)性化治療方案。

 

 

第二個(gè)項(xiàng)目由Ragoussis博士與麥吉爾大學(xué)的Richard Kremer來合作完成。在此項(xiàng)目中Ragoussis博士檢測了血液循環(huán)中腫瘤細(xì)胞分子層面的信息。與腫瘤檢查一樣，這種被稱為“液態(tài)的活體組織切片”中也充滿了各式各樣的癌細(xì)胞，通過它可以實(shí)時(shí)地評估患者當(dāng)下的病情，而且評估結(jié)果比影像學(xué)方法更加精確，與傳統(tǒng)的活體組織切片法相比也是一種微創(chuàng)的方法。由于血液樣本容易獲得，我們就可以在治療前后對腫瘤細(xì)胞的情況都進(jìn)行監(jiān)控。“這可以幫助我們預(yù)測轉(zhuǎn)移行為，也可以使我們看到一種治療方案能否消滅某個(gè)特別危險(xiǎn)的細(xì)胞群，” Ragoussis博士解釋道，“我們最終的目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥，到那個(gè)時(shí)候患有難治性癌癥的病人能夠通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析找到最能抵御疾病的特殊藥物。”

 

Ragoussis博士說：“盡管目前仍處于研究早期，但是我們可以很清晰的看到單細(xì)胞的分辨率比細(xì)胞群體實(shí)驗(yàn)所顯現(xiàn)出的結(jié)果涵蓋了范圍更廣的發(fā)散度，使我們看得更加精細(xì)。如果我們想闡明細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄編程機(jī)制，全外顯子組測序?qū)⒊蔀橥蛔兎治龅谋匾獥l件之一。

 

Ragoussis博士和他的同事們正在籌劃組織來自MUGQIC 的250名研究人員融合新的基因組學(xué)方法和生物信息學(xué)開發(fā)可以廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域的新技術(shù)。

 

他說：“我們的使命就是建立基因組學(xué)研究方法并使它們得到廣泛應(yīng)用。這些相似的單細(xì)胞測序方法幾乎可以為我們研究所有疾病提供啟示。”