羅氏NimbleGen序列捕獲技術實現轉錄組定向測序

瀏覽次數：3667　發布日期：2014-6-4　來源：本站　本站原創，轉載請注明出處

最近在Nature Protocols雜志上在線發表的一篇文章¹介紹了利用NimbleGen序列捕獲技術進行轉錄組定向測序，用于RNA研究中基因發現和表達定量。

RNAseq技術在基因表達研究中得到了廣泛的應用，可對表達基因進行無偏見的采樣。相比定量PCR可以對更廣泛的基因同步分析，相比芯片方法RNAseq測序結果準確性也更高。然而，真核細胞的表達譜具有轉錄本數量眾多、可變剪切情況復雜，且表達量高低差異大的特點。RNAseq測序結果分散在整個基因組中，不同基因測序深度差異顯著，對轉錄水平偏低的轉錄本往往測序深度不足，為進行特定基因的可變剪切體拼接及定量研究造成阻礙。

而序列捕獲技術通過寡合苷酸探針雜交，富集研究所感興趣的基因或基因組區段，實現了定向測序。將此技術與RNAseq結合，即對RNAseq的測序文庫先進行序列捕獲實驗富集感興趣的轉錄本，再進行測序，實現定向RNAseq或RNA捕獲測序（CaptureSeq）。這一方法可以提高目標轉錄本的測序深度，進行靈敏的基因發現、有效的轉錄本組裝和準確的基因表達定量。

文中介紹的實驗步驟主要包括探針設計、捕獲測序和數據分析如轉錄本拼接及定量。實驗選用了羅氏NimbleGen探針用于目標捕獲。NimbleGen可同時生產2萬種探針，可覆蓋多達200Mb的基因組中的分散區域或連續的區域，可以應對復雜的真核生物轉錄組。文章指出，在探針設計時，僅針對目標轉錄本的部分序列設計探針，通過這些探針即可捕獲全長轉錄本，也可發現轉錄本中的新外顯子。當需對特定剪切方式的轉錄本進行定向研究時，可在探針設計包括連接兩個外顯子片段的探針，專門捕獲這些異構體。

此外，實驗設計了用于質控的探針。質控探針包括：1. 非轉錄的基因間區的探針，以排除gDNA污染；2. 其他可能造成實驗室污染如大腸桿菌等的序列捕獲探針，以排除實驗室污染；3. 數個質控基因的探針，可用于進行測序前qPCR富集分析，或用于數據分析參數的測試；4. 針對摻入樣本的ERCC RNA設計的探針。 ERCC RNA Spike-in standards由92個in vitro轉錄的轉錄本組成，表達量跨越一個10⁶的范圍，這一些標準品被摻入到最初的RNA樣品中進行捕獲測序，用于判斷測序量是否充足，以及計算捕獲off-target rate。另外，將各轉錄本獲得的測序深度，與ERCC RNA Spike-in standards的測序深度比較，可以推算出樣本中各轉錄本的數量。文章作者指出，這個方法應用于轉錄水平較低的基因的富集，富集率與基因數量相關，如1000個隨機選擇的基因預期55倍富集效率。

圖：定向RNAseq測序（CaptureSeq）實驗流程。摘自：Tim R Mercer et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nature Protocols.2014 doi:10.1038/nprot.2014.058.

5微克的總RNA約可生成250ng cDNA文庫，可將多個樣本的文庫混合后根據Roche NimbleGen的實驗手冊進行捕獲實驗。混合捕獲的實驗方案可以對大量樣本進行低成本的測序。測序后的分析步驟包括比對、拼接、去除非目標序列、新基因（外顯子）發現、定量等。

通過這一實驗，可以對樣本中特定基因的表達進行研究。該方法既RNASeq相比其他表達譜研究方法的優勢，又可以進行有目的性的、多樣本的研究。尤其在對于表達水平中低等的轉錄本研究中，可以更好地拼接全長轉錄本、發現新基因以及定量分析。

1. Tim R Mercer, Michael B Clark, Joanna Crawford, Marion E Brunck, Daniel J Gerhardt, Ryan J Taft, Lars K Nielsen, Marcel E Dinger, John S Mattick. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nature Protocols.9, 989–1009 (2014) doi:10.1038/nprot.2014.058.

僅用于科研，不用于診斷。

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