德國研究小組開發(fā)出臺式機的基因分型測序法
德國哈雷市（Halle）馬丁·路德大學的研究人員已經(jīng)開發(fā)出適用于低通量臺式儀器的基因分型測序法，如Life Technologies的Ion Torrent PGM，他們認為，這種方法可以應(yīng)用到非模式生物的群體研究中，并可能取代常規(guī)的方法，如微衛(wèi)星基因分型法。
并未參與這項研究的美國得克薩斯州AgriLife研究所基因組學和生物信息學主任查爾斯·約翰遜（Charles Johnson）告訴“In Sequence”說，“這真是一種非常明智的方法，并且相當有用……”。
斯托勒的團隊首次證實，其分別采用TaqI和MseI作為第一種和第二種限制性內(nèi)切酶，通過在兩種蜜蜂樣本中的應(yīng)用，該方法是可重現(xiàn)的。此外，由于限制性內(nèi)切酶能產(chǎn)生極短的片段，該小組還納入了一項大小選擇步驟，只選擇約90個堿基的片段。在PGM 316芯片上對每個文庫進行測序，產(chǎn)生了367萬和271萬reads數(shù)，其平均讀長分別為83個堿基和86個堿基。
接下來，研究小組證明，該方法可以應(yīng)用于無參考序列基因組的物種，在幾種無刺蜜蜂基因組中進行檢驗。對此，斯托勒表示，研究小組只查看了一對位點，但展望未來，研究人員計劃對更多個體和更多的SNP進行基因分型，“甚至希望擴展至整個基因組�！�
約翰遜說，其有可能對該方法進行檢驗，其認為該方法是對其他基因分型測序法（如RAD-seq）的“很好改進”。AgriLife研究所是德克薩斯農(nóng)工大學體系研究所是德克薩斯農(nóng)工大學體系內(nèi)的一個農(nóng)業(yè)和生命科學研究機構(gòu)，目前進行了大量基因分型的測序研究項目，主要集中于植物基因組。
并未參與這項研究的美國得克薩斯州AgriLife研究所基因組學和生物信息學主任查爾斯·約翰遜（Charles Johnson）告訴“In Sequence”說，“這真是一種非常明智的方法，并且相當有用……”。
這項名為RESTseq的方法適用于限制性片段測序，于本月初發(fā)表在“PloS One”期刊上，其與利用限制性內(nèi)切酶從大量樣本中對準所關(guān)注的目標基因組區(qū)的其他基因分型測序方法相類似。
然而，不同之處在于它采用了兩步限制性內(nèi)切酶切割以減少測序的片段數(shù)。在第一步中，該小組采用一種通常能在整個基因組中進行切割的限制性內(nèi)切酶，產(chǎn)生多個片段。隨后，該小組在這些片段上連接了專用于PGM的測序適配器。為減少必須完成的實際測序量，其采用了第二種限制性內(nèi)切酶，以減少文庫大小，從而使PGM測序變得易于進行。
“通過采用多種限制性內(nèi)切酶，我們極大地減少了文庫，以便于分析]1000種以上的SNP”，馬丁·路德大學生物研究所的研究員和論文資深作者�？ㄌ亍に雇欣眨‥ckart Stolle）告訴IS，“我們采用條碼適配器和合并序列對其進行擴增和測序。”
斯托勒的團隊首次證實，其分別采用TaqI和MseI作為第一種和第二種限制性內(nèi)切酶，通過在兩種蜜蜂樣本中的應(yīng)用，該方法是可重現(xiàn)的。此外，由于限制性內(nèi)切酶能產(chǎn)生極短的片段，該小組還納入了一項大小選擇步驟，只選擇約90個堿基的片段。在PGM 316芯片上對每個文庫進行測序，產(chǎn)生了367萬和271萬reads數(shù)，其平均讀長分別為83個堿基和86個堿基。
在第一種限制性內(nèi)切酶進行酶解后，99%的reads啟動了正確的三聯(lián)體。選擇第二種酶以減少AT含量，由此研究人員發(fā)現(xiàn)，事實上，與蜜蜂基因組約32%的總GC含量相比較，這兩個文庫擁有更高的GC含量，約為44%。作者表示，“這種可能富含編碼區(qū)的片段在篩選選擇性群體模式時是非常可取的”。
采用保守性設(shè)置，該研究小組發(fā)現(xiàn)，72%和77%的reads與基因組明確匹配，且分別以20倍和17倍的覆蓋率覆蓋了11.06和10.05的巨堿基。
為了檢驗該方法在無參考序列條件下對基因組的分析能力，研究小組采用兩個樣本的reads進行了de novo組裝，并發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生的contig（重疊群）覆蓋了71%的參考序列，這證實“由于組裝計算，de novo方法比基于參考序列的方法產(chǎn)生較少的共識序列，但對于生成高質(zhì)量的聲分析數(shù)據(jù)仍是可行的�！�
接下來，研究小組證明，該方法可以應(yīng)用于無參考序列基因組的物種，在幾種無刺蜜蜂基因組中進行檢驗。對此，斯托勒表示，研究小組只查看了一對位點，但展望未來，研究人員計劃對更多個體和更多的SNP進行基因分型，“甚至希望擴展至整個基因組�！�
此外，斯托勒還說，其希望改進該方法，以便能夠產(chǎn)生更少的片段。他說，“我們確實希望減少片段的數(shù)量，以便您能夠以較少量片段終止，從而去完成小規(guī)模的基因分型，這與人們處理微衛(wèi)星相類似�！�
微衛(wèi)星基因分型取決于產(chǎn)生已知位點的標記引物。斯托勒認為，該技術(shù)經(jīng)濟劃算且效果良好，但在生物體不具有標記引物的情況下（如其研究小組研究的多個蜜蜂物種），采用按比例減少的迭代RESTseq法似乎更具吸引力，因為該方法不要求具有基因組的先驗知識。
“即使我們事先并未獲得任何信息，只要我們制作了限制性文庫，我們就能 （通過其他限制性內(nèi)切酶酶解）減少文庫，然后對其進行測序�！彼雇欣照f，“最終，該方法將逐漸取代微衛(wèi)星基因分型法。”
約翰遜說，其有可能對該方法進行檢驗，其認為該方法是對其他基因分型測序法（如RAD-seq）的“很好改進”。AgriLife研究所是德克薩斯農(nóng)工大學體系研究所是德克薩斯農(nóng)工大學體系內(nèi)的一個農(nóng)業(yè)和生命科學研究機構(gòu)，目前進行了大量基因分型的測序研究項目，主要集中于植物基因組。
約翰遜補充說，該方法的一個潛在問題是，其在高度重復的區(qū)域進行測序時可能會遇到麻煩。限制性內(nèi)切酶將 “在這些重復區(qū)域內(nèi)造成多個切口”。 約翰遜認為，這可能使該方法在植物應(yīng)用中變得具有挑戰(zhàn)性，如棉花和甘蔗，因為這些植物中具有一段很長的重復序列。
約翰遜說，所有基因分型測序方法都可能存在這方面的問題，但研究人員已經(jīng)獲得一種解決辦法，即采用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶，由于這種酶只剪切轉(zhuǎn)錄活躍的區(qū)域，因而使該過程變得更為容易。約翰遜補充說，也可以在第二次酶解中與RESTseq試驗方案一起使用這種酶，這將使其更適用于處理具有重復序列的物種。
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